_ Metoda CRISPR îmbunătățită permite inserarea stabilă de mari gene în ADN-ul plantelor superioare

Oamenii de știință de la Institutul de Biochimie a Plantelor Leibniz (IPB) au reușit pentru prima dată să introducă în mod stabil și precis segmente mari de gene în ADN-ul plantelor superioare foarte eficient. Pentru a face acest lucru, au optimizat metoda de editare a genelor CRISPR/Cas, cunoscută în mod obișnuit ca „foarfece genetice”.

Metoda CRISPR îmbunătățită oferă oportunități mari pentru modificarea țintită a genelor în plantele superioare, atât pentru reproducere. și cercetare. Studiul, condus de Prof. Alain Tissier și Dr. Tom Schreiber, a fost publicat în Molecular Plant.

CRISPR/Cas este o metodă cu un potențial enorm pentru modificarea țintită a genelor individuale. Cu toate acestea, acest lucru nu se aplică tuturor tipurilor de modificări genetice pe care crescătorii și oamenii de știință le au pe listele lor de dorințe. În timp ce foarfecele genetice sunt ideale pentru a elimina genele, adică pentru a opri sau elimina genele existente, ele nu funcționează bine pentru introducerea precisă a genelor sau înlocuirea segmentelor de gene. Până în prezent, foarfecele genetice au fost prea ineficiente și, prin urmare, de puțină folos pentru inserarea țintită a genelor în ADN-ul plantelor superioare.

„Motivul pentru aceasta este mașina de reparare internă a plantei pentru rupturile ADN”. spune Schreiber. Aceste enzime de reparare sunt prezente imediat de îndată ce se produce deteriorarea ADN-ului. Ei recunosc, de asemenea, tăieturile netede făcute de foarfecele genetice și reunesc instantaneu cele două fire de ADN tăiate ale dublei helix. Această lipire a ADN-ului tăiat se produce foarte repede și nu foarte precis; există pierderi minore de informații în care se pierd sau se adaugă secțiuni minuscule de ADN.

„Aceste inexactități nu reprezintă o problemă în proiectele care nu au fost eliminate și sunt chiar de dorit”, spune Schreiber, „pentru că vreau să dezactivați gena oricum. Dar dacă vreau să inserez o genă, trebuie făcută foarte precis Informația genetică trebuie să fie inserată exact, nu poate lipsi nici o singură componentă și nici o componentă suplimentară nu poate fi integrată. gena își pierde funcția și întregul experiment a fost în zadar.”

Din acest motiv, inserția precisă și fără cicatrice mediată de CRISPR/Cas a genelor mai mari sau a segmentelor de ADN a avut succes doar în cazuri individuale rare pentru a Data. Pentru a crește rata de succes a inserției genelor, oamenii de știință de la Halle au echipat foarfecele genetice cu o enzimă suplimentară, o așa-numită exonuclează.

Exonucleazele pot modifica locurile de clivaj ADN create de foarfecele genetice în astfel de cazuri. o modalitate prin care enzimele de reparare interne ale celulei nu mai pot recunoaște și repara deteriorarea ADN-ului. Segmentul de ADN care urmează să fie introdus de CRISPR/Cas ar avea, așadar, suficient timp pentru a se integra în poziția corectă printr-un alt mecanism de reparare celulară, foarte precis.

În experiment, oamenii de știință de la Halle au testat diferite exonucleaze de origine virală, bacteriană, vegetală și umană pentru capacitatea lor de a crește numărul de evenimente precise de inserare a genelor. Ei au introdus foarfecele genetice cu exonucleazele corespunzătoare și un segment de genă X în celulele frunzelor plantei de tutun Nicotiana benthamiana.

Aceste celule de tutun fuseseră anterior echipate cu o genă pentru un marker verde fluorescent. Ele conțineau, de asemenea, o genă X distrusă, care este necesară pentru formarea colorantului verde fluorescent. Cu toate acestea, markerul fluorescent nu poate fi generat atâta timp cât o mare parte din informația genetică a genei X lipsește.

Marcatorul verde poate fi produs numai atunci când secțiunea de genă lipsă a lui X este reinserată precis folosind CRISPR/Cas , reparând astfel gena X. Fiecare celulă cu inserție reușită a genei va avea apoi fluorescență în verde și cercetătorii pot pur și simplu număra rata evenimentelor de inserție reușită a genei.

Două dintre exonucleazele testate, inclusiv una din familia virusului herpes, s-au dovedit a fi deosebit de eficiente. Folosind acestea, echipa de la Halle a realizat de 38 de ori mai multe evenimente de inserare a genelor perfecte decât numai cu CRISPR/Cas.

Această abordare experimentală a fost apoi testată cu alte gene care urmează să fie încorporate și în alte plante, și anume cresonul thale ( Arabidopsis thaliana) și grâu. Deoarece inserția genei în plantele de tutun a avut loc doar local în frunze, gena integrată a fost pierdută în următoarea generație fiică și, prin urmare, a fost prezentă în genom doar pentru o perioadă limitată de timp.

De aceea, în Arabidopsis și grâu, experții Halle CRISPR au încercat să încorporeze gena în celulele liniei germinale pentru a asigura o moștenire stabilă generațiilor viitoare de plante. Cu ajutorul exonucleazelor testate, apariția genelor stabile, adică ereditare, a avut succes la Arabidopsis cu o creștere de zece ori a frecvenței și la grâu la mai mult de 1% dintre plantele fiice.

„Un procent nu sună prea mult la început”, explică Schreiber, „dar dacă un crescător dorește să introducă o anumită trăsătură în planta sa, ar trebui să analizeze doar în jur de 50-100 de plante fiice din prima generație folosind sistemul nostru optimizat. Metoda CRISPR/Cas pentru a găsi o plantă cu trăsătura dorită. Aceasta ar economisi o cantitate considerabilă de timp în comparație cu metodele convenționale de ameliorare, unde ar trebui analizate 500 până la 1.000 de plante în acest scop.”

De aceea. , metoda optimizată CRISPR/Cas este un instrument promițător pentru inserarea țintită a genelor în plante superioare și, posibil, de asemenea, în alte organisme. În viitor, amelioratorii de plante ar putea folosi această metodă, de exemplu, pentru a reintroduce genele de rezistență pierdute împotriva agenților patogeni din specii sălbatice sau soiuri cultivate vechi în soiurile de elită moderne, cu randament ridicat. În acest fel, trăsăturile de dorit ca acestea ar putea îmbunătăți ameliorarea plantelor și ar putea contribui la dezvoltarea unor soiuri de culturi mai robuste.

Pentru știință, această abordare oferă oportunități mari de a înlocui în mod elegant anumite gene ale plantelor cu copii modificate ale acestora într-un un singur pas. Acest lucru este deosebit de util în elucidarea funcției genelor.

(Fluierul)