_ Construirea imaginilor foton-by- foton pentru a crește conținutul de informații furnizat de microscoape

Lumea microscopiei cu scanare cu laser evoluează rapid, datorită apariției rețelelor de detectoare rapide și compacte. Aceste matrice înlocuiesc detectorul obișnuit cu un singur element al microscoapelor tradiționale de scanare laser confocale, permițând capacități noi și unice.

În timp ce detectoarele convenționale oferă doar valoarea intensității luminii colectate, un detector pixelat permite, de asemenea, înregistrarea distribuția spațială a luminii incidente, construind eficient o imagine mică a zonei iluminate pentru fiecare punct de scanare.

Informațiile spațiale suplimentare furnizate de matricele de detectoare permit o tehnică de super-rezoluție cunoscută sub numele de microscopie de scanare a imaginii (ISM) . ISM construiește computațional o singură imagine dintr-un set de date multidimensionale brute produs de un microscop. Imaginea finală este construită cu un raport semnal-zgomot (SNR), secțiune optică și rezoluție spațială mai bună decât cea a unui microscop confocal tradițional.

În detaliu, rezoluția laterală a imaginii ISM poate depăși Limita lui Abbe până la un factor de doi. Aceste avantaje, însă, sunt obținute prin exploatarea doar a informațiilor spațiale; bioimaginile moderne cu fluorescență pot fi îmbogățite în continuare prin achiziție rezolvată în timp, care permite accesul la informații structurale și funcționale codificate în dinamica fluorescenței (de exemplu, durata de viață a fluorescenței).

Recent, cercetătorii de la Institutul Italian de Tehnologie ( IIT) din Genova a dezvoltat un microscop ISM compact și eficient echipat cu un detector cu matrice cu diodă de avalanșă cu un singur foton (SPAD), capabil să ofere imagini structurale și funcționale de înaltă rezoluție într-o singură arhitectură. Cercetarea este publicată în Advanced Photonics.

Detectorul de matrice SPAD raportat cuprinde 25 de diode independente dispuse într-o grilă pătrată. Dimensiunea mică și citirea asincronă permit detectarea rapidă a fotonilor de fluorescență. Schema de achiziție a datelor, bazată pe metoda domeniului de frecvență digitală (DFD), este o tehnică de eșantionare heterodină care permite construirea histogramei de dezintegrare a fluorescenței cu o rezoluție de timp de până la 400 ps, ​​potrivită pentru majoritatea aplicațiilor de imagistică prin fluorescență.

Tehnica este suficient de simplă pentru a permite calculul histogramei pe aceeași placă FPGA (field-programmable-gate-array) folosită pentru a controla microscopul și a înregistra semnalul detectat, simplificând arhitectura microscopului.

Mulțumită informațiilor spațiale și temporale unice furnizate de detectorul cu matrice SPAD, autorii au demonstrat combinația de măsurători a duratei de viață a fluorescenței (FL) cu ISM (FLISM). Pe lângă beneficiile ISM convenționale, SNR îmbunătățit al imaginilor FLISM permite o estimare mai robustă a duratei de viață a fluorescenței.

Raportul evidențiază versatilitatea microscopului prin combinarea ISM și măsurătorile rezolvate în timp cu reducerea emisiilor stimulate. microscopie (STED), folosind tehnica de separare prin acordare pe viață (SPLIT). Rezultatul este o imagine cu rezoluție laterală îmbunătățită și contrast obținut fără modificarea schemei de achiziție. În plus, măsurătorile rezolvate în timp permit imagistica cu mai multe specii cu un singur detector pentru o specificitate structurală crescută.

Sistemul poate distinge diferiți coloranți cu valorile lor de viață a fluorescenței, datorită reprezentării fazoare a dinamicii fluorescenței. Chiar și folosind coloranți cu valori de viață similare și spectre de excitație suprapuse, se poate distinge diferiții fluorofori folosind tehnica de excitare cu intercalare în impulsuri.

Într-adevăr, prin alternarea impulsurilor de excitație ale laserului cu culori diferite, informațiile spectrale sunt codificate efectiv în dimensiunea temporală. Datorită rezoluției în timp excelente a microscopului propus, contribuția celor doi coloranți fluorescenți poate fi ulterior separată pentru a evita diafonia.

Conform lui Giuseppe Vicidomini, cercetător principal la laboratorul de microscopie și spectroscopie moleculară de la IIT și autorul corespondent, „Rezultatele acestei lucrări sugerează că viitorul microscopiei cu scanare cu laser este strâns conectat la detectoarele cu matrice SPAD, capabile să îmbogățească setul de date de microscopie cu informații spațiale și temporale suplimentare, fără a fi nevoie să se schimbe arhitectura optică a unui microscop confocal. „

Lucrarea demonstrează că detectoarele de matrice SPAD combinate cu un sistem de achiziție personalizat fac ca ISM rezolvat cu fotoni să fie ușor accesibil și utilizabil.

(Fluierul)