21:01 2023-01-31
science - citeste alte articole pe aceeasi tema
Comentarii Adauga Comentariu
_ „Instantanee” ale traducerii ne-ar putea ajuta să investigăm proteinele celulare
_ „Snapshots” ale traducerii ar putea ajutați-ne să investigăm proteinele celulare
Progresele biologiei moleculare au dezvăluit că pep-ARNt - polipeptide în curs de dezvoltare din ribozom care sunt atașate covalent la transferul ARN - sunt implicate în nenumărate funcții celulare, inclusiv în exprimarea genelor. Toate proteinele există ca pep-ARNt la un moment dat, iar studierea acestor intermediari de traducere este vitală, deoarece posedă proprietăți atât ale ARN-ului, cât și ale proteinei și pot ajuta cercetătorii să înțeleagă mai bine specificul traducerii.
În funcție de stimuli și /sau tensiuni, reglarea translațională este foarte rapidă și se întinde la inițiere, alungire și pauză de alungire. Obținerea de informații mai profunde asupra procesului de traducere necesită, prin urmare, o metodă adecvată pentru a procesa pep-ARNt în cantități mari. Aceste nuanțe au alimentat dezvoltarea instrumentelor moleculare pentru a investiga traducerea celulară.
În prezent, cele două abordări principale folosite pentru a studia traducerea celulară folosesc strategii foarte diferite. Primul, profilarea ribozomilor, o tehnologie puternică de secvențiere profundă, monitorizează traducerea prin țintirea fragmentelor de ARNm protejate de ribozomi produse din digestia cu RNază. Din păcate, această abordare este în mod inerent incapabilă de a captura pep-ARNt și este consumatoare de timp, costisitoare și consumatoare de date.
Alternativa se bazează pe proteomica cu cromatografie lichidă-spectroscopie de masă în tandem (LC-MS/MS). ) și necesită utilizarea aminoacizilor neobișnuiți pentru a marca polipeptidele. Cu toate acestea, astfel de abordări proteomice necesită mult timp și, cel mai important, nu surprind starea de alungire a translației a celulei, deoarece pep-ARNt nu sunt vizați direct.
Pentru a naviga în jurul acestor limitări în „ pep-tRNA-ome”, o echipă de oameni de știință de la Institutul de Tehnologie din Tokyo (Tokyo Tech), condusă de prof. Hideki Taguchi, a dezvoltat PETEOS. Descoperirile lor au fost acum publicate în Nucleic Acids Research.
În ceea ce privește principalele avantaje ale muncii lor, prof. Taguchi explică: „Această metodologie fără etichetare este unică prin faptul că îmbogățește și captează rapid pep-ARNt. completând în același timp platformele convenționale de analiză a traducerii.”
PETEOS are patru pași. Mai întâi, ARN-ul este îmbogățit folosind extracția cu solvent organic și apoi izolat pe o coloană de silice. Apoi, polipeptidele țintă din pep-ARNt-urile izolate sunt separate de ribonucleotidele lor folosind o combinație de pH și temperatură ridicate. Apoi, polipeptidele eliberate sunt supuse digestiei enzimatice și scindate. Și, în sfârșit, aceste polipeptide sunt identificate folosind proteomica LC-MS/MS.
„Ca dovadă de concept, am reușit să identificăm aproape 800 de proteine E. coli care au fost derivate din pep-ARNt. folosind PETEOS. Important, aceste proteine au fost îmbogățite cu N-terminali, ceea ce subliniază că metoda într-adevăr captează pool-ul intermediar de pep-ARNt în timpul translației", spune prof. Taguchi, vorbind despre semnificația noii lor metode.
Echipa a reușit, de asemenea, să demonstreze că PETEOS ar putea capta „capturi de ecran” ale nascentomului – grupul de ARNt pep în curs de dezvoltare prezent la un moment dat – atunci când celulele E. coli au fost supuse la șoc termic și tratamente cu antibiotice. PETEOS a depășit metodele convenționale în ceea ce privește capacitatea de a capta expresia acută a proteinelor în condiții de stres termic și rearanjarea nascentomului în urma expunerii la diferite antibiotice.
PETEOS are câteva limitări, inclusiv o dificultate în analizarea nivelului scăzut. abundență pep-ARNt folosind LC-MS/MS, capacitate cantitativă limitată din cauza etapei fenol acid/cloroform, nicio rezoluție la nivel de codon și dificultăți de captare a capătului C-terminal al polipeptidei în creștere. Cu toate acestea, unele dintre aceste probleme există și pentru abordările convenționale și pot fi depășite prin îmbunătățirea eficienței de îmbogățire cu peptidă C-terminală a acestui proces.
Echipa consideră că există un potențial extraordinar de a-și optimiza protocolul în continuare. Prof. Taguchi concluzionează, „În ciuda limitărilor, suntem încrezători că PETEOS are potențial, deoarece permite analize pe care metodele actuale de translatome pur și simplu nu le pot. Cel mai important, poate fi aplicat oricărui organism”. Cu mai multe cercetări în acest domeniu, ne vom aprofunda înțelegerea sintezei proteinelor.
Comentarii:
Adauga Comentariu