_ Condens biomoleculari: Studiul dezvăluie un nivel slab puterea predictivă a testelor de separare a fazelor lichid-lichid consacrate

Celulele bâzâie cu milioane de biomolecule diferite care difuzează haotic prin substructurile lor, dar reușesc să asigure o specificitate funcțională și spațială rafinată.

Distincte. biomoleculele interacționează în mod specific în procesele celulare și conduc la răspunsuri celulare țintite. Acest lucru se realizează adesea prin direcționarea biomoleculelor către compartimentele subcelulare. Compartimentele precum mitocondriile sunt separate spațial de membrane. Alții, precum nucleolii, nu au deloc granițe de membrană.

Cum se formează aceste compartimente fără membrană este încă unul dintre cele mai mari mistere din biologie. În ultimii ani, un fenomen numit separare de fază lichid-lichid (LLPS) a fost propus ca forță motrice a ansamblării compartimentelor.

Grupul lui Andrea Musacchio, director la Institutul de Fiziologie Moleculară Max Planck, a acum a dezvoltat o strategie de validare pentru a evalua rolul LLPS în formarea compartimentelor și pentru a evalua metodele comune pentru detectarea proprietăților LLPS. Studiul este publicat în jurnalul Molecular Cell.

Aplicarea strategiei procesului de asamblare a centromerului în timpul diviziunii celulare, care s-a propus să fie condus de o schelă LLPS (complexul de pasager al cromozomilor sau CPC), nu a reușit să identifice LLPS ca un factor crucial, confirmând puterea predictivă scăzută a acestor teste. Această nouă strategie are potențialul de a deveni un instrument important pentru validarea rolului altor potențiali factori LLPS identificați până acum.

Proteinele, care îndeplinesc majoritatea funcțiilor din corpul nostru prin interacțiunea cu alte proteine, se confruntă cu o dilemă — se mișcă prin celulă cu 40 de milioane de potențiali parteneri de interacțiune.

Găsirea partenerului potrivit poate părea, așadar, ca căutarea unui ac într-un car de fân. Cu toate acestea, dacă probabilitatea ca o proteină să întâlnească partenerul potrivit la momentul potrivit din întâmplare poate părea scăzută - celula a găsit o strategie de a aduce împreună proteinele care seamănă cu întâlnirea cu un potențial partener la locul de muncă, într-o cafenea sau în club: Spațial indicii ghidează proteinele către compartimente celulare definite, cum ar fi membrana plasmatică sau mitocondria.

Procesul de diviziune celulară, de exemplu, este inițiat prin procese de semnalizare la nivelul membranei celulare, care activează enzimele ale căror semnale ajung în cele din urmă. nucleul celulei pentru a declanșa transcripția genelor țintite.

În timpul diviziunii celulare ulterioare, o multitudine de interacțiuni specifice proteinelor duc la formarea unui complex proteic multistratificat la centromerii cromozomilor, care asigură eroarea- distribuția liberă a cromozomilor dintr-o celulă mamă către cele două fiice ale acesteia.

Natura a dezvoltat o anumită chimie pentru interacțiunea proteinelor: proteinele menite unele pentru altele sunt echipate cu interfețe evolutive conservate și expuse, cu identități chimice detaliate în lor. Structura 3D care sunt complementare unele cu altele. Aceste motive se găsesc între specii și permit interacțiuni cu proteine ​​foarte specifice.

La începutul secolului trecut, au fost observate pentru prima dată primele compartimente celulare nedelimitate de granițele fizice. Știm acum că nucleolii, corpii P sau granulele de stres concentrează macromolecule, în principal proteine ​​și ARN, și au funcții importante în celulă.

Descoperirea acestor compartimente fără membrană a deschis un nou domeniu de cercetare. plin de întrebări fără răspuns, dintre care cea mai provocatoare este modul în care se formează aceste compartimente și cum își mențin structura.

În ultimii ani, ideea că aceste compartimente se formează printr-un proces numit demixare lichid-lichid sau lichid -separarea fazelor lichide, comparabilă cu formarea spontană a picăturilor de ulei în apă, a căpătat un impuls considerabil.

În conformitate cu acest punct de vedere, compartimentele fără membrană sunt „condens” a căror formare se bazează pe interacțiuni tranzitorii, slabe și nespecifice ale proteinelor „driver”, determinând în cele din urmă acumularea lor acolo la o concentrație mai mare decât în ​​mediul înconjurător.

Testele care investighează proprietățile de separare a fazelor proteinelor din afara celulei au identificat până în prezent zeci de acești factori, inclusiv complexul cromozomial de pasageri (CPC), despre care s-a afirmat că formează condensate la centromer pentru a-și modula organizarea și funcția. în timpul mitozei.

„Pentru mulți oameni de știință, separarea fazelor a devenit explicația implicită pentru formarea compartimentelor fără membrană. Cu toate acestea, există puține dovezi că testele LLPS efectuate in vitro pot prezice cu adevărat un proces fiziologic în mediul celulei. ,” spune Musacchio.

Împreună cu echipa sa, el a dezvoltat o strategie de evaluare a unui test LLPS utilizat pe scară largă și puterea lui de predicție și a aplicat-o la CPC.

„În cadrul nostru opinia, o slăbiciune majoră a testelor este că nu modelează solventul cu suficientă acuratețe. Solventul definește solubilitatea unei proteine ​​și, prin urmare, capacitatea acesteia de a interacționa cu alte proteine.”

Pentru a imita mediul natural al celulei cât mai aproape posibil, omul de știință a adăugat la standard lizate de celule bacteriene sau de mamifere diluate. Tamponele LLPS, chiar și la concentrații foarte diluate, lizatele au prevenit complet formarea de condens în toate cazurile, adăugarea de lizate celulare a dizolvat „condensurile”.

„Aceste rezultate confirmă presupunerea noastră că mediul celular tamponează în mod eficient interacțiunile slabe nespecifice despre care se crede că provoacă LLPS in vitro”, spune Musacchio.

Interacțiunile și funcțiile proteinelor din celulă sunt puternic reglementate de așa-numitele modificări post-translaționale. Adăugarea sau îndepărtarea țintită a grupurilor de fosfat în locuri critice, de exemplu, poate perturba interacțiunea dintre două proteine ​​cu efect imediat. . Aceste modificări naturale pot fi imitate în laborator prin mutații și reprezintă metoda de alegere atunci când vine vorba de investigarea multor procese celulare.

Prin introducerea mutațiilor la patru reziduuri implicate în recunoașterea indiciilor fosforilate, omul de știință a generat un mutant al CPC care nu poate fi recrutat la centromeri și nu se acumulează acolo. Cu toate acestea, acest mutant a arătat încă potențialul LLPS complet în testul in vitro, arătând că testul este incapabil să prezică localizarea și funcționarea CPC.

"Rezultatele noastre arată că LLPS al unei singure componente in vitro nu poate prezice solubilitatea. și localizarea în mediul complex și aglomerat al celulei Lista presupuselor schele LLPS identificate prin testele stabilite va necesita o reexaminare amplă, iar strategia de validare pe care o prezentăm aici poate ghida acest efort”, spune Musacchio.

„În viitor, intenționăm să ne repetăm ​​experimentele cu multe schele presupuse LLPS, în special cele care au devenit emblematice în creșterea câmpului LLPS. Experimentele noastre arată că citosolul este un solvent puternic al cărui rol nu poate fi neglijat. Prin urmare, va fi important să se genereze medii citomimetice adecvate ca standarde pentru evaluarea reacțiilor biochimice in vitro. Vom încerca să contribuim la acest domeniu de cercetare.”

(Fluierul)