_ Îmbunătățirea acurateței cuantificării moleculare în secvențiere cu randament ridicat

O echipă de la NDORMS a dezvoltat o nouă abordare pentru a îmbunătăți semnificativ acuratețea secvențierii ARN. Ei au identificat sursa principală de cuantificare inexactă atât în ​​secvențierea ARN-ului cu citire scurtă, cât și în cea lungă și au introdus conceptul de corectare a erorilor „vot majoritar” care duce la o îmbunătățire substanțială a numărării moleculare a ARN.

Secvențierea precisă. de material genetic este crucial în biologia modernă, în special pentru înțelegerea și abordarea bolilor legate de anomalii genetice. Cu toate acestea, metodologiile actuale se confruntă cu constrângeri substanțiale.

Într-un studiu de referință, un consorțiu internațional de cercetători, condus de Adam Cribbs, profesor asociat în biologie computațională, și Jianfeng Sun, asociat de cercetare postdoctorală la Institutul Botnar, Universitatea din Oxford, au dezvoltat o metodă inovatoare pentru a corecta erorile în amplificarea PCR - o tehnică utilizată pe scară largă în secvențierea cu randament mare.

Prin identificarea artefactelor PCR ca sursa principală de cuantificare inexacte, cercetătorii abordează o provocare de lungă durată în generarea de numărări absolute precise de molecule de ARN, care este crucială pentru diverse aplicații în cercetarea genomică. Studiul este publicat în revista Nature Methods.

Cercetătorii s-au concentrat pe identificatorii moleculari unici (UMI), care sunt secvențe aleatorii de oligonucleotide folosite pentru a elimina părtinirile introduse în timpul amplificării PCR. În timp ce UMI-urile au fost adoptate pe scară largă în metodele de secvențiere, studiul arată că erorile PCR pot submina acuratețea cuantificării moleculare, în special pe diferite platforme de secvențiere.

Jianfeng a explicat: „Amplificarea PCR, esențială pentru majoritatea tehnicilor de secvențiere a ARN-ului. , poate introduce erori, compromițând integritatea datelor. Am abordat acest lucru prin sintetizarea codurilor de bare UMI folosind blocuri de nucleotide homotrimeri, îmbunătățind corectarea erorilor și permițând cuantificarea aproape absolută a moleculei de ARN, îmbunătățind semnificativ acuratețea numărării moleculare."

Homotrimerii sunt nucleotide. secvențe constând din trei baze identice, de exemplu AAA, CCC, GGG. Evaluând asemănarea nucleotidelor homotrimeri, erorile sunt detectate și corectate printr-o metodă de „vot majoritar” (a se vedea figura de mai sus).

Studiul demonstrează că UMI-urile homotrimeri depășesc semnificativ UMI-urile monomerice tradiționale în reducerea îmbogățirii fals pozitive a pliurilor în timpul analiza genelor și transcriptelor exprimate diferențial (DEG și DET). Această îmbunătățire este vitală pentru identificarea și cuantificarea precisă a DEG-urilor sau DET-urilor, în special în abordările de secvențiere în vrac.

În plus, în secvențierea cu o singură celulă, unde este adesea necesară o amplificare extinsă PCR, UMI-urile homotrimeri s-au dovedit eficiente în atenuând efectele artefactelor PCR, îmbunătățind astfel substanțial fiabilitatea datelor de secvențiere.

„Prin construirea UMI-urilor din blocuri omogene de nucleozide, ne-am propus să îmbunătățim corectarea erorilor atât în ​​secvențierea cu citire scurtă, cât și în cea lungă, prezentând angajamentul nostru de a îmbunătăți aplicațiile tehnologiei de secvențiere”, spune profesorul asociat Adam Cribbs, autor principal al lucrării și lider de grup în biologie computațională.

Această cercetare are implicații profunde. Prin rectificarea erorilor PCR din UMI-uri, crește foarte mult acuratețea cuantificării moleculare în diferite aplicații de secvențiere. Este un instrument vital pentru cercetătorii în ARN-ul în vrac, ARN-ul unicelular și secvențierea ADN-ului, permițând expresia genică și analize precise ale profilului molecular.

Corectarea îmbunătățită a erorilor UMI nu numai că reduce incidența fals-pozitivelor, dar oferă și aplicații multiple de diagnosticare, în special în scenariile care necesită analiza longitudinală a probelor.

(Fluierul)