_ CRISPRing microbiomul este aproape colțul

Până în prezent, enzimele CRISPR au fost folosite pentru a edita genomurile unui tip de celulă la un moment dat: ele taie, șterg sau adaugă gene unui anumit tip de celulă dintr-un țesut sau organ, pt. de exemplu, sau la un fel de microb care crește într-o eprubetă.

Acum, grupul de la Universitatea din California, Berkeley, care a inventat tehnologia de editare a genomului CRISPR-Cas9 cu aproape 10 ani în urmă, a găsit o modalitate de a adăuga sau modifica simultan genele într-o comunitate de mai multe specii diferite, deschizând ușa către ceea ce s-ar putea numi „editare comunitară”.

Deși această tehnologie este încă aplicată exclusiv în setările de laborator, ar putea fi folosită atât pentru editare, cât și pentru pentru a urmări microbii editați într-o comunitate naturală, cum ar fi în intestin sau pe rădăcinile unei plante în care se adună sute sau mii de microbi diferiți. O astfel de urmărire devine necesară pe măsură ce oamenii de știință vorbesc despre modificarea genetică a populațiilor microbiene: inserarea genelor în microbi din intestin pentru a remedia problemele digestive, de exemplu, sau modificarea mediului microbian al culturilor pentru a le face mai rezistente la dăunători.

Fără o modalitate de a urmări inserțiile de gene – folosind un cod de bare, în acest caz – astfel de gene inserate ar putea ajunge oriunde, deoarece microbii împart în mod obișnuit gene între ei.

„Spărgerea și schimbarea ADN-ului în microorganismele izolate a fost esențial pentru înțelegerea a ceea ce face ADN-ul”, a spus colegul postdoctoral de la UC Berkeley, Benjamin Rubin. „Această lucrare ajută la aducerea acestei abordări fundamentale asupra comunităților microbiene, care sunt mult mai reprezentative pentru modul în care acești microbi trăiesc și funcționează în natură.”

În timp ce abilitatea de a „pusca” edita multe tipuri de celule sau microbi la o dată ar putea fi utilă în sistemele actuale la scară industrială - bioreactoare pentru cultivarea celulelor în vrac, de exemplu, aplicarea mai imediată poate fi un instrument de înțelegere a structurii comunităților complexe de bacterii, arhei și ciuperci și a fluxului de gene în cadrul acestor diverse. populațiile.

„În cele din urmă, este posibil să reușim să eliminăm genele care provoacă boli în bacteriile intestinale sau să facem plantele mai eficiente prin proiectarea partenerilor lor microbieni”, a spus colegul postdoctoral Brady Cress. „Dar probabil, înainte de a face asta, această abordare ne va oferi o mai bună înțelegere a modului în care microbii funcționează într-o comunitate.”

Rubin și Cress – ambele în laboratorul inventatorului CRISPR-Cas9 Jennifer Doudna – și Spencer Diamond, un om de știință în cadrul Innovative Genomics Institute (IGI), se numără printre co-autorii unei lucrări care descrie tehnica care a apărut astăzi (6 decembrie) în revista Nature Microbiology.

Din recensământ. la editare

Diamond lucrează în laboratorul lui Jill Banfield, un geomicrobiolog care a fost pionier în domeniul secvențierii comunitare sau al metagenomicii: Secvențierea cu pușcă a întregului ADN într-o comunitate complexă de microbi și asamblarea acestui ADN în genomul complet. dintre toate aceste organisme, dintre care unele probabil nu au mai fost văzute înainte și multe dintre ele sunt imposibil de crescut într-un vas de laborator.

Secvențierea metagenomică a avansat enorm în ultimii 15 ani. În 2019, Diamond a asamblat 10.000 de genomi individuale din aproape 800 de specii microbiene din probe de sol colectate dintr-o pajiște din California de Nord.

Dar el compară acest lucru cu realizarea unui recensământ al populației: oferă informații de neegalat despre microbii care sunt prezent în ce proporții și ce funcții ar putea îndeplini acești microbi în cadrul comunității. Și vă permite să deduceți interacțiuni complicate între organisme și modul în care acestea pot lucra împreună pentru a obține beneficii importante ale ecosistemului, cum ar fi fixarea azotului. Dar aceste observații sunt doar ipoteze; Sunt necesare noi metode pentru a testa efectiv aceste funcții și interacțiuni la nivel de comunitate, a spus Diamond.

„Există această idee a transferurilor metabolice — că niciun microb individual nu îndeplinește un șir imens de funcții metabolice, dar, în cea mai mare parte, fiecare organism individual face un singur pas dintr-un proces și că există să fie un transfer de metaboliți între organisme”, a spus el. „Aceasta este ipoteza, dar cum demonstrăm de fapt acest lucru? Cum ajungem într-un punct în care nu mai urmărim doar păsările, putem de fapt să facem câteva manipulări și să vedem ce se întâmplă? Aceasta a fost geneza editare comunitară.”

Echipa de cercetare a fost condusă de Banfield, profesor UC Berkeley de științe pământului și planetare și de științe de mediu, politici și management, și Jennifer Doudna, profesor de biologie moleculară și celulară UC Berkeley și de chimie, investigator al Institutului Medical Howard Hughes și co-câștigător al Premiului Nobel pentru Chimie în 2020 pentru invenția CRISPR-Cas9 editarea genomului.

Echipa a dezvoltat mai întâi o abordare pentru a determina ce microbi dintr-o comunitate sunt de fapt susceptibili. la editarea genelor. Tehnica de screening dezvoltată de Rubin și Diamond, numită ET-seq (secvențierea transformării mediului), folosește ca sondă un transposon, sau genă de săritură, care se inserează cu ușurință aleatoriu în mulți genomi microbieni. Prin secvențierea ADN-ului comunității înainte și după introducerea transpozonului, aceștia au reușit să identifice speciile de microbi care au putut să încorporeze gena transpozonului. Abordarea s-a bazat pe tehnici dezvoltate de co-autorul Adam Deutschbauer la Laboratorul Național Lawrence Berkeley. Într-un experiment care a implicat o comunitate de nouă microbi diferiți, aceștia au introdus cu succes același transpozon în cinci dintre ei folosind metode de transformare diferite.

Cress a dezvoltat apoi un sistem de livrare țintită numit ARN All-in-one de editare a ADN-ului -CRISPR Cas Transposase (DART) ghidată care utilizează o enzimă CRISPR-Cas similară cu CRISPR-Cas9 pentru a ajunge la o anumită secvență de ADN și pentru a introduce un transpozon cu cod de bare.

Pentru a testa tehnica DART cu un Comunitatea microbiană mai realistă, cercetătorii au luat o probă de scaun de la un copil și l-au cultivat pentru a crea o comunitate stabilă compusă în mare parte din 14 tipuri diferite de microorganisme. Ei au reușit să editeze tulpini individuale de E. coli în cadrul acelei comunități, țintind gene care au fost asociate cu boli.

Cercetătorii speră să folosească tehnica pentru a înțelege comunitățile artificiale, simple, cum ar fi o plantă și ea. microbiomul asociat, într-o cutie închisă. Ei pot apoi manipula genele comunității în cadrul acestui sistem închis și pot urmări efectul asupra microbilor lor codați de bare. Aceste experimente sunt un aspect al unui program de 10 ani finanțat de Departamentul de Energie numit m-CAFEs, pentru analiza comunității microbiene și evaluarea funcțională a solurilor, care urmărește să înțeleagă răspunsul unui microbiom simplu de iarbă la schimbările externe. Banfield, Doudna și Deutschbauer fac parte din proiectul m-CAFEs.

Alți co-autori ai lucrării sunt Alexander Crits-Christoph, Yue Clare Lou, Adair Borges, Haridha Shivram, Christine He, Michael Xu , Zeyi Zhou, Sara Smith, Rachel Rovinsky, Dylan Smock, Kimberly Tang, Netravathi Krishnappa și Rohan Sachdeva de la UC Berkeley; Trenton Owens de la Berkeley Lab; și Rodolphe Barrangou de la Universitatea de Stat din Carolina de Nord.

(Fluierul)