_ Descoperirea mecanismului de ciclizare a ciclicei β-1,2-glucan sintaza

Polizaharidul β-1,2-glucan constă din unități repetate de glucoză legate între ele prin legături β-1,2-glicozidice. β-1,2-glucanii ciclici (CβG) apar la diferite specii bacteriene și au un rol în infecțiile bacteriene și relațiile simbiotice. Biosinteza CβG este catalizată de β-1,2-glucan sintetaza ciclică (CGS), o enzimă care catalizează ciclizarea (formarea inelului închis) a β-1,2-glucanului liniar (LβG).

Deoarece metoda pentru sinteza enzimatică la scară largă a β-1,2-glucanului liniar a fost deja stabilită, combinarea acesteia cu această enzimă este fezabilă din punct de vedere tehnic pentru sinteza eficientă într-un singur vas a β-1,2-glucanului ciclic. Cu toate acestea, activitatea de ciclizare a acestei enzime nu este foarte puternică și are, de asemenea, o stabilitate scăzută ca enzimă.

Studiile anterioare au arătat că legarea glucozei la CGS, alungirea lanțurilor LβG, lanțul glucanului ajustarea lungimii și ciclizarea glucanilor sunt răspândite în trei domenii distincte ale CGS. Cu toate acestea, deși se știe că domeniul enzimatic din regiunea de mijloc a CGS ciclizează LβG, un mecanism detaliat pentru proces a eludat până acum oamenii de știință.

Recent, o echipă de cercetători din Japonia a descoperit cataliticul mecanismul ciclizării CGS în urma analizelor funcționale și structurale ale domeniului de ciclizare CGS din bacteria Thermoanaerobacter italicus (TiCGSCy). Echipa a fost condusă de profesorul asistent Nobukiyo Tanaka de la Departamentul de Științe Biologice Aplicate de la Universitatea de Științe din Tokyo (TUS) și a inclus Br. Ryotaro Saito, profesor asociat Masahiro Nakajima și profesor asociat Tomoko Masaike, toți de la TUS, precum și profesor asociat Hiroyuki Nakai de la Universitatea Niigata și Dr. Kaito Kobayashi de la Institutul Național de Știință și Tehnologie Industrială Avansată (AIST).

Descoperirile lor au fost publicate în revista Applied Microbiology and Biotechnology.

Dr. Tanaka elaborează: „CGS-urile sunt enzime importante din punct de vedere fiziologic, deoarece CβG-urile sunt implicate în diferite boli bacteriene și relații simbiotice. Am fost dornici să oferim perspective asupra structurii și funcției CGS-urilor, care primesc atenție în cercetare, dar pentru care mecanismul de Ciclizarea β-1,2-glucanului rămâne un mister.”

Primul pas al cercetării a implicat exprimarea domeniului de ciclizare singur, TiCGSCy, ca o enzimă recombinantă în Escherichia coli.

Următorul pas către caracterizare a implicat analiza produselor de reacție atunci când LβG-urile au fost utilizate ca substrat pentru TiCGSCy. „Am descoperit că TiCGSCy a produs compuși rezistenți la β-glucozidază. Examinându-i folosind spectroscopie de rezonanță magnetică nucleară, am găsit CβG. Aceasta a fost prima dovadă că TiCGSCy a produs CβG”, explică dr. Tanaka.

Pentru a a determinat modelele de acțiune ale TiCGSCy asupra LβG, echipa a tratat TiCGSCy cu β-1,2-gluoligozaharide (LβG care cuprind 2-10 unități de glucoză) și a analizat produsele. Produsele de reacție au arătat că mecanismului TiCGSCy nu avea o reacție de hidroliză, prezenta transglicozilare și necesita substraturi care aveau cel puțin hexazaharide (polimeri de șase sau mai multe unități de glucoză) în lungime.

Această constatare a corespuns datelor din studiile anterioare. unde CGS-urile înrudite au produs CβG-uri cu polimeri de aproximativ 20 de unități de glucoză. În cele din urmă, s-a sugerat că TiCGSCy are un mecanism de reținere a anomerului, deoarece generează un produs cu același anomer ca substratul său.

În plus, analiza structurală a TiCGSCy folosind cristalografia cu raze X a arătat că TiCGSCy, β-1,2-glucanazele din Chitinophaga pinensis (CpSGL, aparținând GH144) și ciuperca Talaromyces funiculosus (TfSGL, aparținând GH162) sunt similare structural, deși omologia secvenței de aminoacizi a acestora este foarte scăzută.

Structura complexă a CpSGL (GH144), structura complexă Michaelis a TfSGL (GH162) și structura generală a TiCGSCy au fost suprapuse pentru a explora reziduurile catalitice ale TiCGSCy.

Așa cum ca rezultat, s-a descoperit că E1356 este situat într-o poziție de a acționa asupra atomului de oxigen al legăturii glicozidice la locul de clivaj prin intermediul grupării 3-OH a moleculei de glucoză de la subsitul +2, iar E1442 a fost poziționat pentru a efectua direct un nucleofil. atac asupra centrului anomeric al subsite-ului –1. În consecință, s-a dedus că sunt acidul/baza generală și, respectiv, reziduul nucleofil pentru cataliză.

Mecanismul de reacție detaliat al TiCGSCy este următorul:

În reacția menționată mai sus , s-a sugerat că atunci când gruparea hidroxil dintr-o moleculă diferită de cea care formează intermediarul glicozil-enzimă atacă atomul de carbon anomeric din (a), se obține un produs liniar. În schimb, atunci când gruparea hidroxil atacatoare este din aceeași moleculă, se formează un produs ciclic.

În general, aceste constatări au implicații semnificative pentru caracterizarea TiCGSCy. „Având în vedere mecanismul său de reacție noncanonic, acest CGS definește o nouă familie de glicozide hidrolaze, GH189”, spune dr. Tanaka.

În concluzie, prin această cercetare, cercetătorii au identificat reziduuri importante pentru activitatea de ciclizare, care conduce la căutarea dorită a enzimelor cu activitate de ciclizare mai puternică și stabilitate mai mare. Echipa este încrezătoare că munca lor va deschide căi de cercetare care explorează inhibarea CGS.

(Fluierul)