21:42 2024-02-20 science - citeste alte articole pe aceeasi tema
Comentarii Adauga Comentariu

_ ADN-ul nedorit la păsări poate deține cheia unei terapii genetice sigure și eficiente

_ Junk DNA la păsări poate deține cheia pentru o terapie genetică sigură și eficientă

Recenta aprobare a unei terapii CRISPR-Cas9 pentru boala celulelor falciforme demonstrează că instrumentele de editare a genelor pot face o treabă excelentă de a elimina genele pentru a vindeca boala ereditară. Dar încă nu este posibil să se introducă gene întregi în genomul uman pentru a înlocui genele defecte sau dăunătoare.

O nouă tehnică care utilizează un retrotranspozon de la păsări pentru a introduce gene în genom este mai promițătoare pentru terapia genică, deoarece inserează gene într-un „port sigur” în genomul uman, unde inserția nu va perturba genele esențiale și nu va duce la cancer.

Retrotranspozonii sau retroelementele sunt bucăți de ADN care, atunci când sunt transcrise în ARN , codifică enzimele care copiază ARN-ul înapoi în ADN din genom - un ciclu de autoservire care aglomera genomul cu ADN retrotranspozon. Aproximativ 40% din genomul uman este alcătuit din acest nou ADN „egoist”, deși majoritatea genelor sunt dezactivate, așa-numitul ADN nedorit.

Noua tehnică, numită Precise ARN-mediated INsertion of Transgenele, sau PRINT, valorifică capacitatea unor retrotranspozoni de a introduce eficient gene întregi în genom fără a afecta alte funcții ale genomului. PRINT ar completa capacitatea recunoscută a tehnologiei CRISPR-Cas de a dezactiva genele, de a face mutații punctuale și de a insera segmente scurte de ADN.

O descriere a PRINT, care a fost dezvoltată în laboratorul lui Kathleen Collins, profesor de biologia moleculară și celulară de la Universitatea din California, Berkeley, este publicată pe 20 februarie în revista Nature Biotechnology.

PRINT implică inserarea de ADN nou într-o celulă folosind metode de livrare similare cu cele utilizate pentru transportul cu feribotul. CRISPR-Cas9 în celule pentru editarea genomului. Pentru PRINT, o bucată de ARN furnizat codifică o proteină retroelement comună numită proteina R2, care are mai multe părți active, inclusiv o nickază - o enzimă care leagă și rupte ADN-ul dublu catenar - și transcriptaza inversă, enzima care generează copia ADN-ului. ARN. Celălalt ARN este șablonul pentru ADN-ul transgenului care urmează să fie inserat, plus elementele de control al expresiei genice - o întreagă casetă transgenă autonomă pe care proteina R2 o inserează în genom, a spus Collins.

Un avantaj cheie al utilizării proteinei R2. este că inserează transgena într-o zonă a genomului care conține sute de copii identice ale aceleiași gene - fiecare codifică ARN ribozomal, mașina de ARN care traduce ARN-ul mesager (ARNm) în proteină. Cu atât de multe copii redundante, atunci când inserția perturbă una sau câteva gene de ARN ribozomal, pierderea genelor nu va fi ratată.

Punerea transgenei într-un port sigur evită o problemă majoră întâlnită la inserare. transgene prin intermediul unui vector virus uman, care este metoda comună astăzi: gena este adesea introdusă aleatoriu în genom, dezactivând genele de lucru sau dezactivând reglarea sau funcția genelor, ceea ce poate duce la cancer.

" O abordare bazată pe CRISPR-Cas9 poate fixa o nucleotidă mutantă sau poate introduce un mic petic de ADN - fixarea secvenței. Sau puteți pur și simplu elimina o funcție genică prin mutageneză specifică locului", a spus Collins, care deține familia Walter și Ruth Schubert. Președinte.

„Nu eliminăm o funcție a genei. Nu reparăm o mutație a genei endogene. Adoptăm o abordare complementară, care este să punem în genom o genă exprimată în mod autonom, care produce o proteină activă - pentru a adăuga înapoi o genă funcțională ca un bypass deficit.Este suplimentarea transgenelor în loc de inversarea mutației. Pentru a remedia bolile cu pierderea funcției care apar dintr-o multitudine de mutații individuale ale aceleiași gene, acest lucru este grozav.”

Multe boli ereditare, cum ar fi fibroza chistică și hemofilia, sunt cauzate de o serie de mutații diferite ale aceleiași gene, toate care dezactivează funcția genei. Orice terapie de editare genetică bazată pe CRISPR-Cas9 ar trebui să fie adaptată la mutația specifică a unei persoane. Suplimentarea genelor folosind PRINT ar putea în schimb să furnizeze gena corectă fiecărei persoane cu boală, permițând corpului fiecărui pacient să producă proteina normală, indiferent de mutația originală.

Multe laboratoare academice și startup-uri investighează utilizarea de transpozoni și retrotranspozoni pentru a introduce gene pentru terapia genică. Un retrotransposon popular studiat de companiile de biotehnologie este LINE-1 (Long INterspersed Element-1), care la oameni sa duplicat pe sine și unele gene autostopul pentru a acoperi aproximativ 30% din genom, deși mai puțin de 100 din retrotransposonul LINE-1 al genomului nostru. copiile sunt funcționale astăzi, o fracțiune minusculă a genomului.

Collins, împreună cu colegul postdoctoral de la UC Berkeley Akanksha Thawani și Eva Nogales, profesor distins la UC Berkeley la Departamentul de Biologie Moleculară și Celulară și Howard Hughes Medical Investigatorul Institutului, a publicat o structură de microscopie crioelectronică a proteinei enzimei codificate de retroelementul LINE-1 pe 14 decembrie în revista Nature.

Acest studiu a arătat clar, a spus Collins, că retrotransposonul LINE-1 proteina ar fi greu de proiectat pentru a introduce în siguranță și eficient o transgenă în genomul uman. Dar cercetările anterioare care demonstrează că genele inserate în regiunea repetitivă, care codifică ARN-ul ribozomal a genomului (ADNr) sunt exprimate în mod normal, i-au sugerat lui Collins că un retroelement diferit, numit R2, ar putea funcționa mai bine pentru inserarea sigură a transgenei.

Deoarece R2 nu se găsește la oameni, Collins și cercetătorul senior Xiaozhu Zhang și colegul postdoctoral Briana Van Treeck, ambii de la UC Berkeley, au analizat R2 din mai mult de un zeci de genomi animale, de la insecte la crabul potcoavă și alte eucariote multicelulare, pentru a găsi o versiune care a fost foarte țintită către regiunile rDNA din genomul uman și eficientă în inserarea lungimii de ADN în regiune.

„După ce i-am urmărit pe zeci de ei, adevărații câștigători au fost de la păsări”, a spus Collins. , inclusiv cintezul zebră și vrabia cu gât alb.

Deși mamiferele nu au R2 în genomul lor, ele au locurile de legare necesare pentru ca R2 să se insereze eficient ca retroelement - probabil un semn, ea a spus că predecesorii mamiferelor aveau un retroelement asemănător R2 care a fost eliminat cumva din genomul mamiferelor.

În experimente, Zhang și Van Treeck au sintetizat proteina R2 care codifică ARNm și un ARN șablon care ar genera o transgenă cu o proteină fluorescentă exprimată de un promotor de ARN polimerază. Acestea au fost cotransfectate în celule umane cultivate. Aproximativ jumătate din celule s-au aprins în verde sau roșu din cauza exprimării proteinei fluorescente sub lumina laser, demonstrând că sistemul R2 a introdus cu succes o proteină fluorescentă funcțională în genom.

Studii ulterioare au arătat că transgena într-adevăr a introdus în regiunile ADNr ale genomului și că aproximativ 10 copii ale șablonului de ARN ar putea fi inserate fără a perturba activitatea de fabricare a proteinei a genelor ADNr.

Inserarea transgenelor în regiunile ADNr ale genomului este avantajoasă din alte motive. decât le oferă un port sigur. Regiunile ADNr se găsesc pe brațele stupoase a cinci cromozomi separați. Toate aceste brațe stupoase se strâng împreună pentru a forma o structură numită nucleol, în care ADN-ul este transcris în ARN ribozomal, care apoi se pliază în mecanismul ribozomal care produce proteine.

În nucleol, transcripția ADNr-ului este foarte mare. reglementate, iar genele suferă reparații rapide, deoarece orice rupere de ADNr, dacă este lăsată să se propagă, ar putea opri producția de proteine. Ca rezultat, orice transgenă inserată în regiunea ADNr a genomului ar fi tratată cu mănuși pentru copii în interiorul nucleolului.

„Nucleolul este un centru gigant de biogeneză a ribozomilor”, a spus Collins. „Dar este, de asemenea, un mediu de reparare a ADN-ului cu adevărat privilegiat, cu risc oncogen scăzut de la inserarea genelor. Este genial că aceste retroelemente de succes – le antropomorfizez – au intrat în ADN-ul ribozomal. Este multicopie, este conservat și este un port sigur în senzația că poți perturba una dintre aceste copii și celulei nu-i pasă.”

Acest lucru face din regiune un loc ideal pentru a introduce o genă pentru terapia genetică umană.

Collins. a admis că încă nu se cunosc multe despre modul în care funcționează R2 și că rămân întrebări despre biologia transcripției ADNr: Câte gene ADNr pot fi perturbate înainte ca celulei să aibă grijă? Deoarece unele celule opresc multe dintre cele peste 400 de gene ADNr din genomul uman, sunt aceste celule mai susceptibile la efectele secundare ale PRINT?

Ea și echipa ei investighează aceste întrebări, dar modifică și diferitele proteine. și ARN-urile implicate în inserarea retroelementelor pentru a face PRINT să funcționeze mai bine în celulele cultivate și celulele primare din țesutul uman.

Concluzia, totuși, este că „funcționează”, a spus ea. „Doar că trebuie să înțelegem puțin mai multe despre biologia ADNr-ului nostru pentru a profita cu adevărat de ea.”

(Fluierul)

Inapoi